pcr技术的主要步骤和pcr引物设计的一般原则是什么

PCR技术的主要步骤:

1、DNA变性:(90℃-96℃)在热的作用下，双链DNA模板的氢键断裂，形成单链DNA。

2.退火:(60℃-65℃):系统温度降低，引物与DNA模板结合形成局部双链。

3.延伸:(70℃-75℃):在Taq酶的作用下(72℃左右，活性最好)，以dNTP为原料，从引物的3’端向5’至3’端方向延伸，合成一条与模板互补的DNA链。

在每个循环中的变性、退火和延伸之后，DNA含量加倍。目前有些PCR由于扩增区域很短，即使Taq酶活性不是最适，也能在短时间内复制，因此可以改为两步法，即退火和延伸在60℃-65℃同时进行，以减少一次加热和冷却过程，提高反应速度。

2.引物设计的基本原则

1，引物长度:15-30bp，一般在20bp左右。

2.引物碱基:G+C含量40-60%为宜，G+C过少会导致扩增效果不佳，G+C过多容易出现非特异性条带。ATGC最好随机分布，避免超过5个串联排列的嘌呤或嘧啶核苷酸的参照。

3.引物中应该没有互补序列。

4.两个引物之间应该没有互补序列，特别是为了避免3’端的互补重叠。

5.引物与非特异性扩增区序列的同源性不能超过70%，引物3’端的8个碱基不能有待扩增区以外的完全互补序列，否则容易导致非特异性扩增。

6.引物3’端的碱基，尤其是最后一个和倒数第二个碱基要严格匹配，最好的选择是G和C..

7.引物的5’末端可以被修饰。如添加限制性酶切位点、引入突变位点、用生物素、荧光物质和地高辛标记、添加其他短序列，包括起始密码子和终止密码子。

扩展数据

PCR技术的基本原理类似于DNA的自然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR是一种体外DNA扩增技术，它依靠DNA聚合酶在模板DNA、引物和四种脱氧核苷酸存在下的酶促反应，使待扩增的DNA片段经过多次“高温变性-低温退火-引物延伸”三步反应，使DNA片段数量呈指数级增长，从而在短时间内获得大量我们需要的特定基因片段。

在环境检测中，目标核酸序列往往存在于复杂的混合物中，如细胞提取液中，含量很低，因此杂交对检测这种复杂群体中的特定微生物或某个基因并不敏感。通过PCR技术可以将目标序列扩增几个数量级，然后通过探针杂交检测对扩增的序列进行定性或定量的研究和分析。PCR技术经常与其他技术结合使用，如RT-PCR、竞争性PCR、巢式PCR、RAPf、ARDRA等。

第一代PCR是一种普通的定性PCR技术，使用普通PCR仪扩增目的基因，琼脂糖凝胶电泳分析产物。第二代PCR是Real-Time PCR (qPCR)，通过在反应体系中加入能够指示反应进度的荧光试剂，实时监测扩增产物的积累，通过荧光曲线的Cq值来定量初始目的基因的浓度。

第三代PCR技术——数字PCR (dPCR，Dig-PCR)是一种全新的核酸检测和定量方法。它可以通过直接计数目标分子来确定低至单个拷贝的目标分子的绝对数量，而不依赖于任何校准品或外部标准。

PCR芯片技术的发展趋势之一PCR仪器越来越小型化，PCR芯片就是在这种趋势下诞生的。PCR芯片是一种小型化的PCR仪器，在微型载体上进行PCR反应。芯片PCR不仅节省了大量试剂，从而降低了实验成本，而且有助于提高反应速度。

参考资料:

百度百科-PCR技术