为什么pPIC9K在转化酵母时要线性化，为什么不同酶切位点产生的线性化酵母表型不同？谢谢你

线性化有利于目标基因的插入和重组。我们一般在Sal1位点线性化，否则无法通过同源重组整合到酵母基因组中。一般来说，如果选择Sac进行线性整合，重组率更高。

由不同限制性位点产生的线性化酵母的表型如下。

重组质粒βhCG-pPIC9K的构建及毕赤酵母的转化

目的:为了利用基因重组技术表达hCG避孕疫苗抗原，构建了在酵母细胞中表达的重组质粒βhCG-pPIC9K，并转化嗜甲醇酵母。方法:根据βhCG的cDNA序列，设计两条引物，上游为EcoR酶切位点，下游为Not酶切位点，以质粒βhCG-PBS KS为模板进行PCR扩增反应。获得的DNA片段经EcoR和Not酶切，用T4连接酶与pPIC9K质粒连接，导入大肠杆菌DH5α，PCR筛选阳性克隆，双酶切鉴定重组βhCG-pPIC9K，电穿孔转化毕赤酵母。用组氨酸缺陷型MD平板筛选阳性菌株，在含G418的YPD培养基中筛选多拷贝插入菌株。结果:设计的引物扩增出两端带有EcoR和Not酶切位点的βhCG DNA片段，插入pPIC9K和引入DH5α得到阳性克隆。PCR反应和双酶切显示重组质粒为βhCG-pPIC9K。通过转化嗜甲醇酵母获得耐G418菌株。结论:构建了重组质粒βhCG-pPIC9K，获得了插入重组质粒βhCG-pPIC9K的嗜甲醇酵母。

运行前后线性化酵母的比较电泳。切割带应该跑得慢，完整质粒跑在前面。如果酶消化不完全，那么线性化的泳道将有两条带，其中一条与质粒相同。

此外，回收氯仿和乙醇是可行的。

1.加入等体积的酚氯仿，轻轻倒置，均匀5min，10000g离心5min，取上清液，反复加入酚氯仿萃取三次。

2.加入2.5倍体积的3M NaAc，如无水乙醇1/10，混匀，10000g离心2分钟，除去上清液。

3.向沉淀物中加入80%乙醇，润湿，用10000g轻微离心，除去上清液，重复三次。

4.自然晾干，加入10UL(酶切体积为50UL)无酶水，用10倍稀释10UL进行电泳检测，剩余部分-80℃保存。