看微生物——通过基因组测序寻找未知微生物
从培养皿到核酸测序:看微观知识的提升。研究微生物的传统方法大多是通过分离培养单一物种来探索其特性，而未知微生物往往因为生长条件未知而无法培养。此前，研究人员也利用16S rRNA基因广泛存在于几乎所有生物中，但不同物种的序列会有所不同。针对16S rRNA基因，我们在各种* * *同引物测序样本中设计了16S rRNA基因，这样可以知道样本中是否含有新物种【注2】。但这种方法虽然比隔离培养更灵敏，但由于只分析一个基因，只能发现新物种的存在，无法了解其结构或生理功能。
基因组学:拼图随着测序技术的进步，科学家已经可以利用宏基因组学的工具，对样品中的无数微生物同时进行测序，然后获得巨大的片段信息，并与数据库进行比对，从而拼凑出单个物种的基因组。全基因组学最大的优势是可以在毫无头绪的情况下，找出未知来源的基因，探索沿线新的微生物，还可以弥补其他基因信息只靠测序16s rRNA所缺乏的。目前，世界各地的研究团队已经发现了数千种过去无法通过这种方法培育的新菌株。著名的例子有发现于人体口腔[注3]和土壤[注4]的TM7，发现于口腔[注5]的SR-1，附着于水槽水管上的TM6注6]，来自无氧泉水的OP11。然而，测序方法也有一个很大的缺点，因为从一个样本中测序的结果可能包含成千上万个微生物贡献的数万亿个基因片段，所以花费大量的时间和人力来构建基因数据库，并设计一个可以比较和组装基因片段的程序，以获得有意义的结果，仍然是非常具有挑战性的。
单细胞测序:靶向为了更精确地分析单一种类微生物的基因组，研究人员致力于减少测序所需的细胞数量，现在甚至一个细胞就可以测序。目前可以通过细胞分类技术分离单个细胞，然后通过MDA(多重置换扩增)或Malbac(多重退火和基于环的扩增循环)等方法进行测序。
MDA技术与一般PCR的区别在于，它的引物是随机的六码核苷酸，因此几乎可以从任何位置复制；在复制过程中，其特殊的PHI-29核酸聚合酶还能从模板DNA上剥离其他复制的片段并继续前进，分离的片段会被引物连接并再次复制分离，反复形成大量的分支DNA。经过多次循环达到目标数后，可以用S1核酸酶切掉分支形成无分支的DNA，然后进行后续的测序工作。其优点是基因组覆盖率高(单个人细胞可达99%[注9])，但由于等位基因缺失的频繁遗漏和引物间容易相互作用，在解读结果时要特别注意。
而MALBAC则通过设计特殊引物，使得第二轮复制的端到端产物成为一个环，不能再作为下一次复制的模板，从而改善了传统复制过程容易延续上一次错误的情况，使成品更接近原始DNA序列。在用特殊引物进行五轮复制后，MALBAC将使用传统PCR的通用引物增加片段总数，然后确定完整序列。与MDA相比，MALBAC在单个细胞中的基因组覆盖率较低(在单个人类细胞中约为93%[注10])，并且由于前五轮使用的复制酶的错误率略高，往往需要2-3个以上的细胞才能获得最准确的结果；但由于其检测突变的假阳性和假阴性率低、不易遗漏双基因、检测单核苷酸多态性(SNP)效率高的优势，与MDA相比有其自身的优势。而且在获得了初步的基因组序列后，我们其实可以回过头去和整体基因组的多头测序获得的很多片段进行比对，拼凑出一个完整度和准确度都很高的DNA蓝图。
由此可以估计未知微生物的结构、生命运行机制以及与周围环境的相互作用，或者进一步发掘潜在的具有应用价值的抗生素、抗癌药物和化学物质。在99%的未知物种中，一定有很多具有巨大应用价值的基因或蛋白质。当你想到有那么多未知的领域有待探索时，你的探究精神是否与你一起燃烧？
参考文献:1。loceykj &；列侬·JT。美国国家科学院院刊2016；113:5970-5.2.美国国家科学院院刊；87:4576-9.3.Marcy等人，美国国家科学院学报，2007年；104:11889-94.4.Podar M等人应用环境微生物学，2007年；73:3205-14.5.坎贝尔JH等美国国家科学院院刊2013；110:5540-5.6.美国国家科学院学报2013；110:E2390-9。7.优素福NH等应用环境微生物学2011；77:7804-14.8.Dodsworth JA等人国家共同体2013；4:1854.9.帕埃斯人JG等核酸研究2004；32:e71。10.宗C等科学2012；338:1622-6.11.凌等；517:455-9.
本文转载自:遗传学领域最专业的媒体团队GENEONLINE。
主题:基因，微生物，核苷酸