数字PCR(ⅱ)——Bio-rad DD PCR
答:最小液滴加载量与你实验中突变比的灵敏度要求有关。人cfDNA的具体加载要求见下表。
答:根据泊松分布原理，小于等于5拷贝/液滴(100000拷贝/20UL)的核酸浓度可以保证整个群体中存在备用液滴，通过统计转换可以使结果稳定，不需要要求每个液滴都有单个拷贝。20，000个液滴对应65，438+000，000个核酸拷贝。即使丢失了液滴总数，15000液滴的检测限也应该是75000份。
理论上只要有1个负液滴，ddPCR就可以根据泊松分布计算出样本含量，但是CV%会很大。可接受的动态范围为cv%
对于20000个液滴，样品浓度的上限(理论上λ=5.5)对应于99.6%的正液滴、0.4%的负液滴和80个负液滴。也就是负液滴数超过80就OK了。理论上其实可以更少，但考虑到其他不确定性，这个数字更接近实测结果。
答:液滴数不到9000。从统计学上讲，抽样量太小，不能用泊松分布来修正。特别是对于高浓度的样品，定量误差会更大，检出限会降低。如果有多个小孔，由于小孔之间的液滴都是独立的反应体系，可以将多个小孔的数据进行组合分析，可以将小孔视为一个孔。
对于QX200系统，如果反应体积为20微升，则产生的液滴数量约为20，000。实际检测不到20000，往往来自系统死体积、熔滴过渡损失等不确定因素。也就是说，液滴制备后，目标核酸已经随机分布在20000个液滴中，阳性液滴的百分比已经建立，所以后续分析的液滴数小于20000个，对定量结果没有影响(适当浓度的样品)。其实我们也遇到过，同一样品不同批次的液滴总数在4000 ~ 20000不等，但定量结果没有区别。注意，上述说法的前提是“适当浓度的样本”。样品浓度过高或过低，分析的液滴总数会较少，增加另一个环节的二次采样误差，影响定量的准确度和精密度。那么为什么要定义8000滴呢？一方面是基于质量控制。如果达不到这么多液滴，肯定是有问题。建议重做。另一方面，对于超高或超低浓度的样品，8000滴造成的误差仍然小于样品本身的采样误差。
答:样品中的蛋白质、有机溶剂、表面活性剂、高粘度物质、产生液滴时的环境温度、PCR等因素都会影响液滴的数量。血液样本中主要判断是提取时未去除的蛋白质残留和酒精。
答:引物探针一般溶于水或TE，在整个20微升反应体系中所占比例很小，所以对最终反应体系的离子强度或pH值的影响极低。而且ddPCR反应的预混料本身就是缓冲液，可以保持相对稳定的pH值，样品一般用TE或者纯水洗脱，如果萃取没有问题，对体系没有影响。唯一可能的情况是极高的盐离子浓度增加了液滴的渗透压，影响了内外相平衡。而人的血液是等渗溶液，所以不会有这么高的盐浓度，除非是提取试剂盒出了问题，样品中过高的离子浓度通过柱子浓缩也洗不掉。与样品中的蛋白质、有机溶剂、表面活性剂和高粘度物质相比，离子对液滴的影响很小。
答:有效液滴数大于65，438+00，000，液滴高度在65，438+0维图中没有出现阶梯状排列，可以认为液滴是稳定的。
需要在几个方面区分a: DD PCR实验的有效性:
理论灵敏度为1拷贝核酸。实际的灵敏度需要针对您的不同检测和不同提取方法进行具体分析，并且不同检测和不同浓度范围的可重复性是不同的。你需要参考文献，你自己的实验，或者FDA医疗器械注册的验证数据。
一般很少谈一个PCR仪的分析灵敏度，因为每个不同的序列可以判断为不同的分析物，同一方法对不同分析物的LLD、BLD、AS、FS都是不同的，需要精确到不同的应用方向和试剂。
答:Bio-rad不同的ddPCR supermix产生的液滴体积是不一样的，这也是为什么在设置实验时要在软件中正确选择相应的supermix类型，软件会自动调用相应试剂的液滴体积进行计算。不同试剂的液滴体积已通过测试获得，并在开发时应用于quantasoft软件的计算。
答:1。单孔液滴数不够，2。单孔样本量不够，3 .需要计算技术重复之间的平均值和置信区间。如果在实验中重复执行技术，通常建议通过合并技术来分析重复的液滴，这可以提高数据的准确性。
答:在双ddPCR实验中，如果两个反应之间存在干扰或竞争(一般四个液滴不可能在一条矩形线上)，用套索法划分液滴会更准确。(如有实例，可现场讨论)
这两个定量结果其实并不矛盾。然而，是否使用拷贝数或突变率作为通过ddPCR开发的突变检测分析的LOD仍有待讨论。对于液体活检，同时分析两个检测结果更实用。个体倾向于使用拷贝数浓度，而野生型结果对于IPC是必不可少的。突变率的测定可能会受到样品制备的影响。
如果添加了新的荧光标记或者阴性液滴的背景荧光信号为阴性，则需要进行校正和补偿。